Для анализа вам необходимо первичным внешним осмотром отобрать пчёл соответствующих морфологическим признакам среднерусской пчелы. Если на тергитах есть желтизна, то дальнейшая проверка не имеет смысла.
Если Вы не имеете возможности сделать самостоятельно морфометрический анализ пчёл и готовы прислать нам пробу Почтой или СДЭК, то мы готовы сделать анализ для Вас. Если вы готовы делать анализы для других людей — напишите нам!
Стоимость анализа для реестра пробы в 30 пчёл — 800 руб. В случае хорошего результата и добавления Вас в реестр стоимость ДНК-анализа и пересылки пробы обсуждается отдельно.
Морфометрический анализ породности пчел по жилкованию крыла с выбором 4-х образцов для дальнейшего ДНК-анализа в соответствии с процедурой подтверждения породности семей для реестра СР пчёл.
Программное обеспечение:
- Программа для расстановки точек на готовых снимках крыльев и создания tps-файла (файла с координатами необходимых точек) (Скачать)
- Программа «Порода по крыльям» Анатолия Борисовича Карташева. (Скачать)
- Программа по выбору ДВУХ пчел из главного пика по кубитальному индексу для ДНК-анализа (Скачать)
- Не обязательно: Бета-версия программы по автоматической расстановке точек и создания tps-файла. Будет дорабатываться. (Скачать)
Инвентарь:
- Пылесос автомобильный портативный для сбора проб (не обязательно) (OZON, Willberies)
- USB-микроскоп или сканер (3200 dpi минимум, 4800 dpi оптимум). Микроском удобно иметь со столиком и экраном.
- Скотч
- Пинцет
- Ножницы
- Маркер для нумерации ячеек
- Планшет с нумерованными ячейками (можно использовать любое решение)
- Микропробирки 1,5мл по 4 шт на пробу (OZON)
- Спирт для консервации
- Налобная лупа (желательно, но необязательно)
- Налобный фонарик (необязательно)
Вопросы вы можете всегда задать команде проекта в группе в Телеграмм.
Основная задача метода определить в пробе наиболее типичных пчел в этой семье и наиболее близких к гибридам, для принятия решения о пригодности матки для дальнейшей селекции по «породной» принадлежности. Две пчелы из наиболее типичных в пробе и две пчелы с наибольшим показателем кубитального индекса (у всех других подвидов кубитальный индекс больше, чем у среднерусской) отправляются на дополнительное исследование по ДНК.
Как выбирать пробу
Чтобы уменьшить погрешности от миграции пчёл рекомендуется собирать самых молодых пчёл с лупящегося расплода сразу в баночку со спиртом. Для чего рамка с такими пчёлами ставится на небольшом расстоянии от семьи, где нет лёта. Следует следить, чтобы при отборе пробы в спирт не попала случайная лётная пчела. Осенью может быть удобнее использовать автомобильный пылесос с последующей заморозкой контейнера. Далее в любом случае пробу необходимо хранить в спирте. Чем дольше хранятся пчёлы, тем сложнее сделать ДНК. Подмор для ДНК-анализа не годится.
Начало анализа. Подготовка и фото крыльев.
Есть два способа делать фото крыльев — с приклеиванием на скотч и фотографирование без скотча по одному. Как поступать решает каждый сам. Ниже используется способ с наклеиванием, но это не обязательно. Главное, чтобы номера фото соответствовали номерам пчёл на планшете.
| Плюсы | Минусы | |
|---|---|---|
| С приклеиванием крыльев на скотч | — Если очередность при фотографировании сбилась или данные вообще пропали по любым причинам всё можно восстановить повторной съёмкой. | — Бракованные крылья (дефектные, поврежденные при наклеивании) видно уже только после фиксации и их нельзя заменить. — Качество фотографий из-за скотча и связанных с ним дефектов хуже для автоматического распознания. |
| Фотографирование без скотча по одному | — Качество фото максимальное. — Сразу видно дефектные крылья (поврежденные, нарушения в жилковании, грязь в местах постановки точек. | — Нужен навык работы с покрывным стеклом (например на мокрую). — Чуть дольше, чем при автоматизации съёмки благодаря скотчу. Если что-то пошло не так и фото пропали (или не были сделаны) восстановить очередность сложно. |
Крылья приклеиваются на скотч последовательно, номер пчелы на планшете соответсвует номеру крыльев по порядку приклеивания. Если не клеить, а сразу фотографировать, то любой сбой в работе микроскопа (пропуск или двойной кадр) может внести ошибку в нумерации исправить которую уже будет сложно.
В результате получается набор из пчёл и соответствующих им крыльев. В конце лента с пчелами маркируется, сверху наклеивается второй скотч.
С помощью цифрового микроскопа или качественного сканера производится фотофиксация крыльев по порядку с сохранением нумерации. Разрешение изображения очень важно для точности измерения. Ширина крыла должна быть не хуже 1500 px (пикселей, точек), а желательно более 2000 px, иначе погрешности вычисления индексов могут дать неверный результат.
Расстановка точек
На компьютере с помощью программы по расстановке точек WingsDig формируется файл *.tps, который потом загружается в программу А.Б.Карташева «Порода по крыльям». Можно пользоваться и другими программами по расстановке точек, например автоматической, если это удобнее и качество изображений позволяет, но в ней необходимо проверить результат. Программа ещё в бета-версии и не всегда работает точно.
Анализ результатов
Программа «Порода по крыльям» выдает результат обработки ваших крыльев. Во вкладке «Результаты» вы можете посмотреть результат соответствия крыльев определенному подвиду.
Убеждаемся, что семья соответствует СР (Apis mellifera mellifera) не менее 90%, иначе она не подходит для целей реестра и отсылать на ДНК уже нет необходимости.
Отбор проб для ДНК-анализа
На этой же вкладке «Результаты» можно выбрать двух пчёл с самым большим Кубитальным индексом (Сi). Эти две пчелы ближе всего к гибридности по Ci. Их нужно поместить в микропробирки и промаркировать по номеру крыла и номеру семьи. В нашем случае это 12 и 29.
Обе пчелы (12 и 29) попали в 14-й класс — самый правый на графике на вкладке «График Ci». Вторые две нужно брать из главного самого высокого пика графика. (Это может для вас сделать автоматически программа по выбору ДВУХ пчел. Далее описан алгоритм ручного выбора.) В нашем случае это 11 класс, что соответствует значению Ci 1,4 – 1,5. Пчёл с таким значением больше всего (8 шт) в пробе № 6, 7, 8, 10, 11, 13, 18, 25
Далее переходим в вкладку «График DsA» где можно посмотреть на главные самые высокие пики графика по дискоидальному смещению и тарзальному индексу, чтобы выбрать наиболее типичные из тех, которые попали в главный пик по кубитальному индексу (Ci) на прошлом шаге. В этой пробе это № 6 и 13. Это самые средние — самые типичные пчёлы в семье и вероятность передачи этого набора дочкам по соответствию подвиду будет максимальной. Именно их и стоит отправлять на анализ ДНК.
Выбранные 4 пчелы (2 из крайнего значения Ci + 2 из пика графика Ci) перекладываются в микропробирки, заливаются спиртом, маркируются и отправляются на анализ ДНК в лабораторию.
Вопросы вы можете всегда задать команде проекта в группе в Телеграмм.